- Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp sinh endoglucanase dùng trong thủy phân sinh khối thực vật
- Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07
- Họ và tên Nghiên cứu sinh: Phan Thị Tuyết Minh
- Họ và tên cán bộ hướng dẫn: 1. PGS.TS Lê Gia Hy – Viện Công nghệ sinh học; 2. PGS.TS Trần Đình Mấn – Viện Công nghệ sinh học
- Cơ sở đào tạo: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam
TÓM TẮT NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Gene mã hóa endoglucanase từ chủng Bacillus amyloliquefaciens VLSH08 đã được tách dòng có ORF gồm 1500bp mã hóa cho 499 amino axit và được đăng ký trên GenBank với mã số HQ 4459381.1. So sánh trên ngân hàng gene, trình tự endoglucanasse tương đồng 95,5 % về amino axit với endoglucanase từ chủng Bacillus subtilis BS-2 (EU022560.1) và Bacillus amyloliquefaciens TB-2 (EU022559.1).
- Đã thiết kế thành công hệ biểu hiện tái tổ hợp hệ gene gồm vector pHT43, promoter từ gene α-amylase của chủng B. subtilis 168M, gene endoglucanase từ chủng vi khuẩn VLSH 08 và terminator của gene α-amylase từ chủng vi khuẩn 3BT2 trong B. subtilis 168M. Hoạt tính của chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M đạt 6,7IU/ml, cao gấp 23 lần so với chủng dại VLSH08.
- Đã tối ưu được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gene endoglucanasse của chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với 3 biến là môi trường LB 80%, nồng độ glucosse 4g/l, K2HPO4 - 0.5; KH2PO4 - 0,5; (NH4)3PO4 - 0,8g/l, nhiệt độ 37oC, pH6 và nồng độ tryptophan 0,8g/l. Lên men chủng tái tổ hợp trên môi trường tối ưu xác định hoạt tính endoglucanase đạt được 19,3 IU/ml sau 60 giờ lên men.
- Sản phẩm endoglucanase thu nhận từ dịch lên men chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M có độ tinh sạch tăng lên 5,5 sau lọc màng lọc cut off 60 kDa và 30 kDa. Sau sắc ký trên cột HiTrap DEAE FF, endoglucanase có độ tinh sạch tăng lên gấp 6,3 lần, hoạt tính riêng đạt 121 IU/mg. Trên điện di đồ SDS-PAGE, xác định được khối lượng phân tử của endoglucanasse khoảng 35kDa. Endoglucanase tái tổ hợp có : topt: 60oC; pHopt: 6.0 tương tự như endoglucanase nguyên thể từ chủng dại B. amyloliquefaciens VLSH 08. Các thông số động học endoglucanase được xác định theo phương trình Lineweaver-Burk là Vmax = 0.0341 mg/ml/min và giá trị Km = 0.63283 mg/ml.
